介紹

腸桿菌科、大腸桿菌和大腸菌群是常見的食品傳染性細(xì)菌。對(duì)這些病原體的檢測(cè)和量化是微生物食品和臨床診斷實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)重要任務(wù)。

包括生化鑒定在內(nèi)的傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法已經(jīng)應(yīng)用了很長(zhǎng)時(shí)間。這些方法耗費(fèi)時(shí)間和試驗(yàn)材料。以前的研究顯示，大腸菌群，特別是大腸桿菌可作為食品和水污染的指示菌。它們的存在標(biāo)示著飲用水和食品也受到了其他腸道病原菌的污染。因此在檢測(cè)食品衛(wèi)生方面，它們的分離和計(jì)數(shù)具有非常重要的作用。

ISO 6579-2003 描述了有關(guān)沙門氏菌在食品和飼料中的檢測(cè)方法，它一共包括四個(gè)步驟，并且需要確證試驗(yàn)，需要持續(xù)5-7天，即：1.非選擇性液體培養(yǎng)基中的前增菌；2.液體培養(yǎng)基中的選擇性增菌；3.接種選擇性培養(yǎng)基；4.對(duì)可疑菌落進(jìn)行血清學(xué)和生化鑒定。

沙門氏菌屬是導(dǎo)致胃腸炎的常見原因，對(duì)于它的檢測(cè)，需要從糞便樣本中分離病原菌。傳統(tǒng)使用乳糖、pH指示劑，用于鑒別沙門氏菌（非乳糖發(fā)酵菌）。然而，經(jīng)常有必要篩選許多其他的共生菌，如變形桿菌，它也不能發(fā)酵乳糖。篩選共生菌是一個(gè)耗時(shí)的過程，并且所需的血清學(xué)和生化鑒定試劑比較昂貴。

對(duì)天然污染食品樣品的分析顯示，用顯色培養(yǎng)基對(duì)菌落計(jì)數(shù)和分離更加容易，特別是對(duì)蠟樣芽孢桿菌。顯色培養(yǎng)基中包含人工添加的顯色底物，可被一些微生物特異的活性酶所裂解。

在過去30年中，一些病原菌靶向的高特異性顯色培養(yǎng)基開發(fā)出來了。這些培養(yǎng)基采用了酶底物，經(jīng)水解后釋放出生色染料，導(dǎo)致病原菌形成帶顏色的菌落，可輕易地與共生菌群相鑒別。理想狀況時(shí)，共生菌群應(yīng)被選擇性因子*抑制，或形成無色菌落，從而使靶向病原菌從背景菌群中“脫穎而出”。因此，它可區(qū)分含有這種酶的微生物和不含有這種酶的微生物。當(dāng)樣本含有多種菌群時(shí)，這一點(diǎn)對(duì)于檢測(cè)特定的病原菌特別重要。而底物和水解產(chǎn)物對(duì)微生物生長(zhǎng)不應(yīng)有抑制效應(yīng)。本次研究旨在評(píng)估兩種顯色培養(yǎng)基對(duì)于從食品中檢測(cè)和分離腸桿菌科的效率。

材料與方法

培養(yǎng)基制備

腦心浸出液肉湯（BHI,Difco labortaries, USA），選擇性培養(yǎng)基用于革蘭氏陰性菌，麥康凱瓊脂（Fluka BioChemika）,EMB瓊脂（HiMedia Laboratories）和四硫磺酸鈉煌綠肉湯(OXOID)用于大腸菌群和腸道致病菌，而亞硫酸鉍瓊脂（HiMedia）、HE瓊脂（OXOID）、XLD瓊脂（BD）和SS瓊脂（Biolife）用于分離沙門氏菌屬。

兩種用于檢測(cè)大腸桿菌和其他大腸菌群的顯色培養(yǎng)基進(jìn)行了制備，分別為HiCrome ECC瓊脂(HIMEDIA)和沙門氏菌鑒別瓊脂（Raj Hans Medium, HIMEDIA）。每種顯色培養(yǎng)基制備時(shí)煮沸而不用高壓滅菌。

食品樣本

46個(gè)不同的食品樣本（雞蛋、色拉、奶制品、肉和加工過的大米）從伊拉克首都巴格達(dá)的當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)上購(gòu)買。

用不同培養(yǎng)基分離細(xì)菌

每種樣本取25g加入到225ml生理鹽水，每種0.1ml樣本均液制備3個(gè)稀釋度，分別在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。平板在37度孵育24小時(shí)，使顯色培養(yǎng)基中充分顯色。

生化分析

指數(shù)生長(zhǎng)期的分離菌落用API 50 CHL試劑盒（梅里埃）進(jìn)行分析，遵循說明書進(jìn)行。

結(jié)果和討論

檢查了46種不同食物樣本。所有46個(gè)樣品都包含腸桿菌科的混合菌群，其中大腸桿菌（n=28）、肺炎克雷伯氏菌（n=7），沙門氏菌屬（n= 30）。在ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂菌上，每個(gè)分離的菌落都表現(xiàn)為特定顏色。食品樣品的貯溶液含有多種類型的細(xì)菌，ECC瓊脂上鑒別的顏色如圖1所示。ECC上的大腸桿菌呈藍(lán)紫色（圖2）。

圖1.

圖2.

沙門氏菌在兩種顯色培養(yǎng)基上表現(xiàn)為：腸炎沙門氏菌在ECC上為無色菌落（圖3A），傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌在沙門氏菌鑒別瓊脂上是粉紅色（圖3B）。

圖3A

圖3B

肺炎克雷伯氏菌在沙門氏菌鑒別瓊脂上為藍(lán)色菌落（圖4A），在ECC上為綠色（圖4B）。

圖4 A

圖4 B

對(duì)分離的菌落初步鑒定是基于革蘭染色。麥康凱瓊脂能從形態(tài)上檢測(cè)到腸桿菌科。從食品樣本接種到增菌培養(yǎng)基如腦心浸液肉湯、麥康凱瓊脂、EMB瓊脂、BS瓊脂、HE瓊脂、TB肉湯、XLD瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基上都出現(xiàn)腸桿菌科的大量生長(zhǎng)，這使得難以分離疑似細(xì)菌。在比較用于腸桿菌科檢測(cè)的顯色培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)現(xiàn)ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂適合腸桿菌科成員，并適合用作食品中腸桿菌檢測(cè)的指示培養(yǎng)基。用顯色培養(yǎng)基（ECC沙門氏菌鑒別瓊脂）替代麥康凱瓊脂和EMB瓊脂培養(yǎng)基，會(huì)使背景菌下降大約50%，然而并不減少待測(cè)菌的菌落數(shù)量。

有趣的是，來自食物樣本的背景菌群受到強(qiáng)烈抑制。使用顯色培養(yǎng)基分離的沙門氏菌菌落，通過多價(jià)沙門氏菌抗血清得到證實(shí)，其血清型為特定的O和H。分離株的終確任是通過API 50試劑盒來確定腸桿菌科成員的糖發(fā)酵能力。它可用于腸桿菌科成員的鑒別。

近年來，生物技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)導(dǎo)致食品檢測(cè)技術(shù)的改變。今天，我們受益匪淺于那些比傳統(tǒng)方法更特異、更快速且通常具有更高靈敏度的方法。含有乳糖的培養(yǎng)基，加上pH指示劑，傳統(tǒng)上用于從共生菌如大腸桿菌中鑒別出沙門氏菌。傳統(tǒng)顯色的原理是基于糖發(fā)酵，產(chǎn)生局部pH下降引發(fā)培養(yǎng)基中的指示劑顏色的變化?？偟膩碚f，我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，兩種類型的顯色培養(yǎng)基有利于快速檢測(cè)食物中的細(xì)菌，并具有高度選擇性，不需要高壓滅菌，而傳統(tǒng)培養(yǎng)基則需高壓滅菌，非常耗時(shí)，而且價(jià)格貴，選擇性差。這些結(jié)果與其他人報(bào)告相一致（見注1）。

分離鑒定食品源性菌如腸桿菌科，在顯色培養(yǎng)基上為適合，這是因?yàn)橛捎谶@些菌的代謝活性與培養(yǎng)基中的底物反應(yīng)，使菌落產(chǎn)生顏色而得以分離。在許多研究中，顯色培養(yǎng)基已被證實(shí)顯示出超過傳統(tǒng)的培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)，無論是目標(biāo)病原菌的檢測(cè)率上，還是混合菌群的區(qū)分上。顯色培養(yǎng)基因?yàn)榘@色底物，肯定要比傳統(tǒng)培養(yǎng)基更貴，但這可以通過減少對(duì)補(bǔ)充試劑的需求、減少與平板制備以及可疑菌落鑒定相關(guān)的勞動(dòng)時(shí)間來抵消。由于這些因素，在診斷實(shí)驗(yàn)室中使用顯色培養(yǎng)基日益廣泛。很可能在未來幾年內(nèi)針對(duì)更廣泛的病原體分離的顯色培養(yǎng)基越來越多。Hicrome ECC瓊脂和沙門氏菌鑒別瓊脂在快速檢測(cè)食品病原菌方面就是其中兩款翹楚。

結(jié)論

從這項(xiàng)研究中可見，ECC和沙門氏菌鑒別瓊脂顯示中高特異性和靈敏度，這與其他報(bào)告一致。然而，該研究的局限是只采用了兩款篩查腸桿菌的顯色培養(yǎng)基。也可能有其他替代品用于更便宜地對(duì)腸桿菌科進(jìn)行日常檢查，以促進(jìn)傳染病防控措施的啟動(dòng)。

注1. Obeng-Nkrumah N, Twum–Danso K, Krogfelt KA, Newman MJ(2013). High levels of extended spectrum beta lactamase in a amajor teaching hospital in Ghana: The need for regular monitoring and evaluation of antibiotic resistance. Am. J. Trop. Med. Hyg. 98:960-964.

注2.該論文中提到的HiMedia生產(chǎn)的兩款顯色培養(yǎng)基，具體為

HiCrome ECC Selective HiVeg Agar Base（貨號(hào)MV1294）（需添加劑，貨號(hào)FD190）

Salmonella Differential HiVeg Agar（貨號(hào)MV1078）

出處：非洲微生物學(xué)研究（African Journal of Microbiology Research）. 2015，9(49): 2354-2357