細(xì)胞培養(yǎng)是一種無(wú)菌技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無(wú)微生物和不受其他有害因素的影響。為防止微生物污染和有害因素的影響，細(xì)胞培養(yǎng)室要求環(huán)境清潔，空氣清新、干燥、無(wú)塵。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室由無(wú)菌操作區(qū)、孵育區(qū)、制備區(qū)、儲(chǔ)藏區(qū)、清洗和消毒滅菌區(qū)6部分組成，這些區(qū)域的共同特點(diǎn)是房間要寬敞、明亮，地面要便于清潔、防滑，墻壁的質(zhì)地光滑堅(jiān)硬，儀器設(shè)備布局合理，方便操作，避免交叉干擾，陳設(shè)簡(jiǎn)潔，便于清掃。

一、無(wú)菌操作區(qū)

無(wú)菌操作區(qū)是只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無(wú)菌操作的區(qū)域，最好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。在一般環(huán)境的空氣中，由于存在許多塵埃和雜菌，較易造成污染。

因此，接種工作要在空氣經(jīng)過(guò)滅菌的環(huán)境里進(jìn)行，小規(guī)模的無(wú)菌環(huán)境可利用超凈工作臺(tái)創(chuàng)造，大規(guī)模的需建無(wú)菌室。

理想的無(wú)菌操作室應(yīng)劃為三部分：

1. 更衣室―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

2.緩沖間―位于更衣間與操作間之間，用于準(zhǔn)備工作，還有防止污染的作用，以保證操作間的無(wú)菌環(huán)境，同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱以及必需的小型儀器。

3.無(wú)菌操作間―無(wú)菌操作間則專用于無(wú)菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)，其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過(guò)高以保證紫外線的滅菌效果；墻壁光滑*以便清洗和消毒，無(wú)菌操作間容積小且為密閉式，一般無(wú)菌操作間的空氣消毒用紫外線燈，有的實(shí)驗(yàn)室使用無(wú)臭氧紫外線消毒器或電子消毒滅菌器。

凈化工作臺(tái)：操作簡(jiǎn)單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺(tái)主要有兩種：

（1）側(cè)流式或稱垂直式。

（2）外流式或稱水平層流式。

二、孵育區(qū)

孵育區(qū)也稱培養(yǎng)區(qū)，本區(qū)對(duì)無(wú)菌的要求雖不比無(wú)菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無(wú)塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來(lái)往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行，后者費(fèi)用高，一般實(shí)驗(yàn)室多采用孵箱進(jìn)行工作。

三、制備區(qū)

制備區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。應(yīng)設(shè)有試劑柜、器械柜、實(shí)驗(yàn)臺(tái)和上水道、電源等，配備的主要儀器設(shè)備有水純化裝置、天平、微波爐、pH計(jì)、抽氣泵、電爐、培養(yǎng)分裝器、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶等。

在有天平、pH計(jì)、磁力拌器等設(shè)備下完成制備以后，應(yīng)在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行過(guò)濾除菌。液體制備直接關(guān)系組織細(xì)胞養(yǎng)的成敗，因此必須嚴(yán)格無(wú)菌操作。

四、儲(chǔ)藏區(qū)

儲(chǔ)藏區(qū)主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無(wú)菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無(wú)塵。為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般為液氮溫度-196℃。

細(xì)胞的凍存過(guò)程需要一系列程序降溫，一般為4 ℃下存放30min。轉(zhuǎn)放-20 ℃ 1 h，再轉(zhuǎn)入-80—-70℃過(guò)夜，之后才可以轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(-196℃)。因此儲(chǔ)存區(qū)必須配備冰箱、低溫冰箱、超低溫冰箱和液氮罐等設(shè)備。

五、清洗和消毒滅菌區(qū)

清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開(kāi)，主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作，應(yīng)備有高壓蒸汽滅菌鍋、細(xì)菌過(guò)濾設(shè)備、電熱干燥箱、消毒柜、排風(fēng)設(shè)備等。

六、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)要求

1.環(huán)境要求

溫度：儀器還是操作對(duì)溫度沒(méi)有特殊要求，維持舒適的溫度即可，比如18~26度。

濕度：過(guò)高的濕度會(huì)導(dǎo)致微生物的滋生，所以建議正常維持濕度在70%以下。

潔凈度：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)潔凈區(qū)并沒(méi)有要求，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)里面只有細(xì)胞操作的時(shí)候要求無(wú)菌的環(huán)境，這時(shí)要求有局部的百級(jí)，通常可以利用超凈臺(tái)或者生物安全柜來(lái)實(shí)現(xiàn)，不過(guò)有時(shí)候?yàn)榱擞袀€(gè)更好一點(diǎn)的環(huán)境，減小超凈臺(tái)過(guò)濾器更換的時(shí)間，會(huì)維持室內(nèi)的潔凈度，比如萬(wàn)級(jí)的潔凈度。

無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌環(huán)境要求很高，在細(xì)胞操作時(shí)，一般需要在100級(jí)空氣質(zhì)量條件下進(jìn)行。

在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。

照明：滿足實(shí)驗(yàn)用的操作照度，通常在300LUX。

2.圍護(hù)結(jié)構(gòu)要求

雖然實(shí)驗(yàn)的操作對(duì)大環(huán)境沒(méi)有特殊要求，不過(guò)最好能有不產(chǎn)塵、不積塵的環(huán)境，能保證室內(nèi)的清潔，并且易于清洗、不容易滋生微生物，所以在選擇維護(hù)結(jié)構(gòu)時(shí)，選用彩鋼板、醫(yī)療板等潔凈板材是比較好的選擇，為了保證室內(nèi)的通透性，可以布置密閉窗。

3.消毒

通常做完實(shí)驗(yàn)后，都需要做終末消毒，室內(nèi)需要安裝紫外燈，利用紫外燈對(duì)空氣和表面消毒。

德國(guó)MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對(duì)支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無(wú)殘留, 無(wú)腐蝕, 無(wú)致癌性，操作簡(jiǎn)單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，簡(jiǎn)稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測(cè)結(jié)果可定量。

④操作簡(jiǎn)便。

缺點(diǎn)：①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。